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肿瘤抗原特异性TCR (T cell receptor, T细胞受)基因转导技术

1991年,利用人体免疫系统可产生既能识别突变蛋白,又能识别非突变的自身抗原的T细胞的能力,使第一个真正意义上的肿瘤相关抗原的克隆成为可能。大量可能的肿瘤抗原已经被特征化,包括那些在恶性肿瘤中过表达的正常蛋白(例如,p53或是癌胚抗原),差异化抗原,比如被T细胞受体-1(MART-1)或肿瘤特异性抗原受体(CTA)家族成员所识别的恶性黑素瘤抗原。Clay等人使用伽马逆转录病毒载体转导外周血淋巴细胞,第一次描述了带有肿瘤相关抗原T细胞受体的人类T细胞的基因工程技术。接下来的报道使用了相似的基因转导技术,旨在对抗MDM2和WT-1肿瘤相关抗原。自这些报道发表的十年里,研究者已经在增加TCR基因转移效率的技术上取得了重大进步。


成功进行TCR基因转化的第一步是选择基因转移的方法。现已证明,使用一般实验室的化学法进行基因转移,很难去转染用于TCR基因转移的靶T细胞。相反的,已经证实了电穿孔法或核转染法能带来高效的基于RNA表达体系的基因转移(DNA水平上的基因转移导致了低效率以及电穿孔后期细胞的存活力低)。尽管对于实验室研究来说,RNA电穿孔是一个极有用的方法,但是对于应用到人体还是难以发展成为临床上的方法。在以RNA为基础的TCR基因转移过程中,主要的反馈作用是转移后期RNA表达的半衰期。一个针对于基于转座子的DNA表达卡盒的电穿孔新系统,在应用到人体方面上已经小有成效,并且作为一个临床手段在不断地发展完善。


几乎所用的TCR基因转移临床试验都基于病毒载体表达系统。伽马逆转录病毒载体已经被应用到人体临床研究超过20年之久,并且是一个极具活力,极其完善的临床试剂。人类细胞的伽马逆转录病毒载体基因工程产物的仅知道的毒性被报道在免疫缺陷病人造血干细胞基因工程技术一文中。2003年,在治疗X相关的严重结合免疫缺陷病的基因治疗实验中,插入性引起白血病是被报道发生在三个孩子身上。还没用相似的报道指出经基因工程改造过的成熟细胞,如T淋巴细胞,会产生载体相关的毒性。有效的伽马逆转录病毒载体表达平台的实例包括基于MFG/SFG,MP71/SF91,和MSGV1的载体系统。这些优化载体长末端重复序列调控的高水平转录是成功进行人类T细胞基因工程改造的关键。选择伽马逆转录病毒载体是基于慢病毒载体。尽管慢病毒载体近来才被应用到人体上,但是在有效感染微量刺激的T细胞方面存在基础的生物学优势。慢病毒载体也为转移更复杂、更大的基因表达卡盒提供了可能性,比起伽马逆转录病毒载体可能有更为安全染色体整合特性。在选择病毒表达系统地过程中,似乎在2个逆转录病毒系统中,在基因转化效率和表达潜力方面没有什么差异。


如同设计特异性TCR表达卡盒一样,构建有效表达载体是重要的。TCR分子是由一条α链和一条β链组成的异源二聚体,这两条链必须在基因工程改造过的细胞里以相似的水平共表达。起初,TCR分子的两条链是在两个单独的载体中表达,若是在一个载体中,则选择两个单独的启动子,或是通过内部核糖体进入位点连接两条链。这些方法经常导致低表达,如今已被更高效地应用小核糖核酸病毒的核糖体转换多肽来接两条链的方式所取代。尽管使用核糖体转换多肽会在第一条链的羧基末端留下几个氨基酸残基,但是细胞间TCR分子α链和β链的尾部不会影响T细胞识别信号


可能在一个有效的TCR基因转移系统的发展过程中,最重要的一步是选择特异性受体进行转移。标靶同种抗原的TCR之间存在着明显的不同,包括亲和性以及还不甚了解的影响蛋白热力学的因素,这些都将指导有效或者主要的TCR的选择。例如使用噬菌体展示技术的方法,通过诱变筛选已经获得了高亲和性的TCR。这些技术可以制备出极其高亲和力的TCR,它们如同可溶性试剂一样,具有显著地特性,但是这些超高亲和力的受体在转移回T细胞时,会丧失其特异性。一个更为直接地在互补决定区进行单个或者双重氨基酸替换的方法,已经证明了多重TCR的有效性,这将不存在明显的特异性丧失。通过对多重(细胞毒性T细胞)CTL克隆进行专一性筛选,可以筛选出高亲和力(用来描述识别肿瘤相关抗原的T细胞的总量)的T细胞克隆,并且转入这些TCR能将高亲和表型特征转给转导后的细胞。最终证实,使用HLA-A2品系反义基因小鼠是一种有效的方法,来分离识别人类TAAs的鼠的TCRs。这些TCRs是在T细胞对人类多肽表位尚未产生中枢免疫耐受,并且生成高亲和力的CTL的免疫应答环境下产生的。


现已证明,蛋白质工程在优化转化的TCRs的功能方面起到一定的作用。这些修饰包括糖基化位点的转移,不同肽链间氨基酸的翻转,两肽链间第二个半胱氨酸的引入,以及包含人类TCRs不同区域的鼠的TCRs恒定区的嵌合蛋白的产生。做这些改变的目的不仅是要增加TCR的亲和性,还要设计去产生TCR链的特异性配对。特异性TCR链配对能够增加基因工程T细胞对抗靶抗原的整体活性。到目前为止,最有效增加特异性TCR链配对的策略是使用嵌合型TCRs,在鼠的TCR恒定区不仅促进了特异性链配对,同时也更为严谨地结合了CD3蛋白。近年来,两个研究组独立工作的结果表明,仅一个鼠的TCR氨基酸集团需要被替换到人类TCR的恒定区,以获得高效的配对与活性。在以鼠为例的TCR基因转移过程中,通过TCR错配会产生自体激活的T细胞,这种自体激活能被上述所介绍的技术减少。尽管自体激活在TCR基因转移过程中是一个理论方面的问题,并且在动物实验中被报道出来,但是在临床的试验中,应用携带二次人类TCR的基因工程T细胞来治疗100多个病人,发现介绍过的TCR并没用直接产生毒性。


目前,本公司正在通过提高之前介绍的TCR链的特异性配对以及定点诱变可变区内的互补决定区来增强多肽/MHC识别力的方法,可以增强T细胞受体活性。


该技术对转移性黑色素瘤等某些恶性实体瘤有特效。


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